Сергей Петрович Боткин родился 5 сентября 1832 года в Москве в богатой купеческой семье. Его отец, Пётр Кононович Боткин, был купцом первой гильдии и основателем крупной фирмы, занимающейся оптовой чайной торговлей с Китаем. Сергей был одиннадцатым ребёнком от второго брака Петра Кононовича. Выжили только четырнадцать детей: 9 сыновей и 5 дочерей.

В 1845 году домашним учителем С. П. Боткина был приглашён студент Императорского Московского университета А. Ф. Мерчинский. Для подготовки к поступлению в университет Василий Боткин в 1847 году определил Сергея в частный пансион Эннеса полупансионером. В 1847—1850 годах Боткин учился в частном пансионе Эннеса, считавшемся лучшим в Москве. Затем он поступил на медицинский факультет Московского университета, где учился с 1850 по 1855 год.

После окончания университета Боткин отправился на Крымскую войну в отряде Н. И. Пирогова, в качестве ординатора Симферопольского госпиталя. В 1859 году он был приглашён в клинику терапии Императорской Медико-хирургической академии. В 1860 году Боткин прибыл в Санкт-Петербург и защитил докторскую диссертацию на тему: «О всасывании жира в кишках». В 1861 году он был назначен профессором Императорской Медико-хирургической академии.

Боткин был известным врачом-терапевтом, патологоанатомом, физиологом и общественным деятелем. Он стоял у истоков женского медицинского образования в России и организовал школу фельдшериц и Высшие женские врачебные курсы. Боткин был членом Медицинского совета Министерства внутренних дел и председателем Общества русских врачей. Он также был членом главного управления Общества попечения о раненых и больных воинах, гласным Петербургской думы и заместителем председателя Комиссии общественного здравия Санкт-Петербурга.

Боткин был лечащим врачом многих деятелей науки и культуры, включая Д. И. Менделеева, Ф. М. Достоевского, М. М. Антокольского, И. Я. Гинцбурга и других. Он также консультировал Ф. И. Тютчева, А. И. Герцена, А. И. Эртеля, А. К. Толстого, Д. И. Писарева, С. Я. Надсона, А. Ф. Кони.

Одной из больших заслуг Боткина явился его вклад в исследование роли Южного берега Крыма для санаторно-курортного лечения. Он одним из первых отметил замечательные климатические условия Южного берега для больных туберкулёзом.

Сергей Петрович Боткин скончался 12 декабря 1889 года в Ментоне.